点突变对基因组结构及功能有非常重要的影响，也在人类致病遗传变异中占重要地位【1】，但其功能研究一直缺少合适的高通量筛选平台。近年来研究者开发的单碱基编辑工具CBE（Cytosine Base Editor）和ABE（Adenine Base Editor）可高效精准的诱导C --T及A—G点突变【2,3】，这为点突变功能的高通量筛选奠定了基础【3】。不过目前单碱基编辑工具在点突变筛选中的应用依然有限，相应的高通量筛选平台依然有待建设与完善。

2021年2月18日， Cell杂志背靠背在线发表Broad研究所HHMI研究员John G. Doench实验室的Massively parallel assessment of human variants with base editor screens及哥伦比亚大学欧文医学中心Alberto Ciccia实验室的Functional interrogation of DNA damage response variants with base editing screens研究论文。两篇文章均以单碱基编辑工具CBE为基础，开发出点突变功能研究的高通量筛选新平台。两文研究者还借助新的筛选平台分别对ClinVar数据库中的数万种点突变及近百种DNA损伤应答（DDR）基因的点突变功能进行高通量分析，为高通量筛选新平台的未来应用及DDR基因的功能研究打下了良好的基础。

文章一中研究者首先开展CBE系统用于点突变高通量筛选的可行性分析。利用针对性的筛选文库和正向/负向筛选，研究者指出，以CBE工具BE3.9max为基础的高通量筛选新平台能有效发现功能失活性（LOF）的点突变。研究者还以与癌症发生关系密切的DNA损伤应答基因BRCA1和BRCA2为研究对象，进一步证实了新平台在筛选LOF点突变中的有效性。

随后，研究者利用筛选平台对影响靶向药物敏感性和耐受性的基因点突变进行分析：研究首先选取的是癌症中异常高表达的MCL1和BCL2L1两种抗凋亡基因，两者间存在合成致死关系且有对应的靶向药物MCL1-i和BCL2L1-i。高通量筛选结果证实了单碱基编辑工具在点突变筛选研究中的有效性，但筛选后的功能研究也证实了后续验证的必要性：特定条件下，CBE会在活性窗口之外诱导出重要点突变，这只有通过后续验证方能发现。此外，研究者还针对有多种靶向抑制剂的PARP1基因开展点突变筛选，结果发现多种点突变可改变药物的敏感性和耐受性，部分点突变的功能还具有抑制剂特异性：甚至对不同抑制剂有截然相反的影响。

最后，研究者对ClinVar数据库中3584种基因的52,034种点突变进行高通量筛选，以研究顺铂和潮霉素处理后影响细胞存活的关键点突变，结果发现众多DNA损伤修复基因的LOF点突变在其中扮演重要角色。

与文章一类似，文章二开篇便在三种细胞系中验证单碱基编辑工具CBE用于点突变高通量筛选的可行性和普适性。随后研究者针对86种DDR基因开展筛选实验以研究不同药物处理下影响细胞存活的关键点突变，结果发现53BP1、TRAIP等蛋白中存在功能各异的功能失活性点突变（LOF）、功能获得性点突变（GOF）及功能分离性点突变（SOF）。此外，研究者还发现，ATM激酶中的不同点突变会对基因组稳定性产生截然相反的影响，而乳腺癌中功能未知的CHK2激酶点突变也通过筛选研究被证实为LOF突变。

总体而言，两文证实了以单碱基编辑工具CBE为基础开展点突变高通量筛选的可行性。在此基础上，文章一还针对影响靶向药物敏感性和耐受性的基因点突变进行筛选，并针对ClinVar数据库的数万种点突变开展高通量筛选，证实了点突变高通量筛选在药物研发和系统性研究中的应用潜力。文章二则对DDR基因的点突变功能进行了系统分析，为后续DDR基因的功能研究及其与人类疾病的关系奠定了基础。当然，单碱基编辑工具为基础的点突变筛选依然有诸多不足之处，筛选后的验证也必不可少，但其应用潜力毋庸置疑且值得深入挖掘。

原文链接

https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.01.012

https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.01.041

 文章来源：bioart

1.Rees, H.A. & Liu, D.R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nat Rev Genet (2018).

2.  Komor AC, Kim YB, Packer MS, Zuris JA, Liu DR. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420-424 (2016).

3.  Gaudelli, N.M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471 (2017).